Né à Versailles en 1963, après des études de philosophie et de lettres, Denis Podalydès a suivi le cours Florent puis intégré le Conservatoire supérieur national d'art dramatique. Entré en 1997 à la Comédie-Française, sociétaire depuis 2010, il y est actuellement comédien et metteur en scène (Cyrano de Bergerac en 2006 et Fantasio en 2008, souvent repris depuis dans le cadre de l'alternance). En 2003, Emmanuel Bourdieu a réalisé un documentaire sur une journée particulière à la Comédie-Française : Les Trois Théâtres.
Il est régulièrement à l'affiche au cinéma (notamment dans les films de son frère Bruno), comme à la télévision (Sartre, l'âge des passions de Claude Goretta). En 2009-2010, Denis Podalydès mettait en scène Fortunio à l'Opéra-Comique, jouait Le Cas Jekyll au Théâtre national de Chaillot et, dans la Salle Richelieu, L'Avare de Molière et Calogero di Spelta dans La Grande Magie d'Eduardo de Filippo, puis reprenait Matamore dans L'illusion comique de Corneille.
Il incarne le rôle-titre de La Tragédie du roi Richard II de Shakespeare lors du Festival d'Avignon 2010. Outre de nombreux livres-CD et autres enregistrement sonores, Denis Podalydès a publié plusieurs ouvrages, dont Scènes de la vie d'acteur (Seuil/Archimbaud, 2006), Voix off (Mercure de France, prix Femina Essai 2008), et La Peur Matamore (Seuil/Archimbaud, 2010).